راهنمای رفع عیب در کار با HPLC

 چگونه رایج ترین مشکلات را در هنگام کار با HPLC تشخیص دهیم واصلاح نماییم

اگرچه بهبود و ارتقا کارآیی روش کروماتوگرافی مایع با بازده بالا HPLC با پیشرفت های متعدد در فناوری های مربوط به ساخت دستگاه و ستون های جداسازی توسعه پیدا کرده است ، با این حال بخش های مهم یک سیستم HPLC مشابه هم هستند ، چه شما از یک سیستم قدیمی و نسبتا ساده استفاده کنید و یا از یک سیستم مدرن تر. از سوی دیگر در هر بخش از یک سیستم HPLC ممکن است مشکلاتی بروز کند که بر کل سیستم تاثیر بگذارد. در این مبحث برخی از مشکلات معمول و رایج حین کار با HPLC مطرح می شوند و مورد بررسی قرار می گیرند. در انتهای مبحث نیز جدولی وجود دارد که حاوی خلاصه ای از مشکلات رایج و راه حل های آنها می باشد.

تشخیص مشکلات در HPLC و یافتن علت آنها

یک سیستم HPLC از بخش های متعددی تشکیل شده است و به همین دلیل منشا مشکلات در این سیستم می تواند بسیار متنوع باشد. برای حل منطقی و درست هر مشکل لازم است ابتدا تعریف صحیحی از آن داشته و سپس قادر به مکان یابی و جدا کردن آن از بخش های دیگر باشیم.به همین منظور ، مشکلات رایج و معمول را در ارتباط با بخش های مختلف HPLC بصورت افتراقی و جداگانه مطرح و راه حل هایی برای آنها به شرح زیر ارائه می نماییم :

الف- چگونه از مشکلات مرتبط با فاز متحرک پرهیز نماییم

معمولا حساسیت کم ، خط پایه ( baseline ) غیر ثابت و صعودی ، نویز و یا ارتعاش های روی کروماتوگرام که از آنها با عنوان spike یاد می شود ، همگی به فاز متحرک نسبت داده می شوند. ناخالصی ها و آلودگی ها در فاز متحرک بطور خاص در شستشوی شیبدار ( gradient ) دردسرزا هستند. در این شرایط ، خط پایه ( baseline ) ممکن است روند صعودی مستمر پیدا کند و پیک های غیر واقعی با افزایش میزان ناخالصی ها و آلوده کننده ها افزایش یابند.

آب معمول ترین منشا آلودگی در آنالیز های فاز معکوس است. بنابراین باید در هنگام آماده سازی فاز متحرک فقط از آب مقطر با خلوص بالا یا آب دیونیزه استفاده کرد. با اینحال ، برخی از دیونایزرهای رایج ، آلوده کننده های آلی را به داخل آب وارد می کنند. برای حذف این آلوده کننده ها ، بهتر است آب دیونیزه را از خلال زغال فعال (charcoal ) یا از یک ستون C18 از نوع preparative عبور داد.

برای اجتناب از بروز مشکلات مرتبط با فاز متحرک ، استفاده از حلال ها ، نمک ها ، واکنشگر های ion pair و اصلاح کننده های باز ها و اسید های HPLC grade ضروری است. خالص سازی یا پاک کردن حلال هایی که کیفیت پایینی دارند، کاری وقت گیر است و معمولا مقادیر جزئی از آلوده کننده ها در آن ها باقی می ماند. این مقادیر جزئی از آلوده کننده ها هنگام کار با آشکارساز UV یا فلورسنس با حساسیت بالا بطور حتم باعث بروز مشکلاتی خواهند شد.

از آنجا که بسیاری ازبافر های مایی باعث افزایش رشد باکتری ها یا جلبک ها می شوند ، باید این محلول ها را بصورت تازه تهیه و پیش از استفاده ، آنها را با استفاده از فیلتر 0.2um یا 0.45um   صاف کرد. ممکن است وجود پارتیکل ها در هر یک از اجزا فاز متحرک باعث ایجاد نویز در خط پایه ( baseline ) یا مسدود شدن ستون جداسازی شود. جدا کردن پارتیکل ها از فاز متحرک نیز با فیلتر کردن قابل انجام می باشد.

برای جلوگیری از رشد میکرو ارگانیسم ها در بافر های مایی می توان حدود 100ppm از سدیم آزید به آن ها اضافه کرد. مخلوط کردن بافرها با یک حلال آلی نظیر اتانل یا استونیتریل به میزان 20 درصد یا بیشتر ، راه دیگری برای ممانعت از رشد میکروارگانیسم ها است.

برای جلوگیری از شکل گیری حباب باید فاز متحرک گاززدایی ( degassing ) شود. معمولا برای این کار از یک گاززدا که از تکنیک خلا بهره می برد ( vacuum degasser ) استفاده می شود ❶ اما دمیدن گاز هلیم ، در صورتی که فاز متحرک حاوی اجزاء فرار نباشد، راه دیگری برای جلوگیری از تشکیل حباب در فاز متحرک است.

باید از واکنشگرهای ion pair با دقت استفاده کرد. طول بهینه زنجیره و غلظت واکنشگر باید برای هر آنالیز تعیین شود. می توان غلظت بهینه واکنشگر را بین 0.2mM و 150mM یا بیشتر تعیین کرد. بطور کلی افزایش غلظت یا افزایش طول زنجیره موجب افزایش زمان های بازداری ( retention time ) می شود. غلظت های بالا تر از 50 درصد استونیتریل یا برخی حلال های آلی دیگرمی تواند موجبب رسوب کردن واکنشگرهای ion pair شود. برخی نمک های واکنشگرهای ion pair نیز در آب غیر محلول هستند و رسوب می کنند. به منظور جلوگیری از این رویداد باید به جای بافرهای حاوی پتاسیم ، از بافرهای حاوی سدیم در حضور اسیدهای سولفونیک با زنجیره بلند ( مانند سدیم دودسیل سولفات ) استفاده کرد. 

اصلاح کننده های اسیدی و بازی فرار نظیر تری اتیل آمین ( TEA ) و تری فلوراستیک اسید ( TFA ) برای هنگامی که می خواهیم یک ترکیب را برای آنالیز بعدی بازیابی کنیم ، مناسب هستند. این اصلاح کننده ها به اجتناب از مشکلات همراه با واکنشگرهای ion pair هم کمک می کنند.TEA با غلظت 0.1 تا 1 درصد یا TFA با غلظت 0.01 تا 0.15 درصد را می توان به بافر اضافه کرد. افزایش غلظت ممکن است باعث بهبود شکل پیک مربوط به یک ترکیب خاص شود اما در عین حال ممکن است زمان های بازداری را تغییر دهد.

شکل 1 : نمای ساده ای از اجزا مختلف یک سیستم HPLC

 

 

 

ب- تشخیص و رفع مشکلات مرتبط با پمپ

وظیفه پمپ HPLC عبارت است از انتقال حلال با جریان پایدار و ثابت به ستون جداسازی . مشکلات مربوط به پمپ معمولا به راحتی قابل تشخیص و اصلاح هستند. برخی از نشانه های رایج که بیانگر مشکلات احتمالی در پمپ هستند عبارتند از زمان های بازداری غیر معقول و غیر قابل انتظار برای آنالیت ها، نویزی بودن خط پایه ( noisy baseline ) و یا ارتعاشات و خیزش هایی( spikes ) در کروماتوگرام.

وجود نشت (leak ) در اتصالات داخلی یا خارجی پمپ ( fitting ها یا seal ها ( منجر به بروز اشکال در فرآیند های جداسازی و تعیین مقدار آنالیت ها می شوند.. تجمع ورشد نمک ها در یک اتصال پمپ ، نشانه مهمی از وجود نشت یا leak به حساب می اید. در صورت استفاده ازنمک های بافر ، سیستم HPLC باید بصورت مرتب و روزانه با آب تازه دیونیزه شسته شود تا آثار نمک ها از روی اتصالات پمپ پاک شود. همچنین ، آب بند های پمپ ( pump seals ) باید به صورت دوره ای و هر چند وقت یک بار جایگزین و تعویض شوند.

به منظور تشخیص و رفع مشکلات خاص مرتبط با دستگاه ، توصیه می گردد بخش " رفع عیب و نگهداری " از دفترچه راهنمای عمل دستگاه مطالعه شود. یک کاربر با تجربه HPLC به جای انتظار برای وقوع یک مشکل ، اقدام به نگهداری معمول و قاعده مند دستگاه می نماید و بدین ترتیب سیستم HPLC خود را از مشکلات احتمالی تا حد امکان دور می نماید.

 

 

پ- شناسایی و رفع مشکلات مرتبط با تزریق کننده نمونه ( injector ) و حلال های تزریقی

وظیفه اینجکتورعبارت است از تزریق سریع نمونه به داخل مسیر فاز متحرک ، بدون آنکه در جریان فاز متحرک قطع یا گسست قابل توجهی رخ دهد. سیستم های HPLC مدرن از لوپ های با حجم ثابت یا متغیر و نیز سیستم های تزریق سرنگی استفاده می کنند. این تزریق کننده ها بصورت دستی ، پنوماتیکی یا الکتریکی فعال می شوند.

مشکلات مکانیکی مرتبط با اینجکتور نظیر نشت ( leak ) ، گرفتگی لوله کاپیلاری یا فرسوده شدن آب بندها ( seals ) به راحتی قابل تشخیص و رفع هستند. باید برای ممانعت از مسدود شدن ستون ناشی از آسیب فیزیکی آب بند اینجکتور( injector seal ) از یک فیلتر پیش ستون استفاده کرد.

حل برخی مشکلات مرتبط با اینجکتور مانند تکرارپذیری اندک و یا غیر قابل قبول تزریق ها ، مشکل تر است. عدم ثبات و متغیر بودن ارتفاع پیک ها و دو شاخه یا پهن شدن پیک ها ممکن است ناشی از عوامل مختلف مانند ناکامل پر شدن لوپ های نمونه ، عدم سازگاری حلال تزریقی با فاز متحرک یا حلالیت ضعیف نمونه باشند. تا حد امکان باید نمونه ها را در حلالی از جنس فاز متحرک حل و تزریق کرد. در غیر این صورت باید اطمینان کسب کرد که حلال تزریقی دارای قدرت شویندگی کمتری از فاز متحرک باشد. ( جدول 3 ) .

ادامه دارد ...

 

-----------------------------------------------------------------------------------

 

❶ در دستگاه های DanChrom HPLC یکی از مدرن ترین سیستم های vacuum Degasser برای حباب زدایی از فاز متحرک بکار رفته است.

 

گردآوری وتنظیم : کورش کرباسیان


1399-11-27 13:04
بازدید : 50