مروری کوتاه بر کروماتوگرافی مایع با بازده بالا ( HPLC ) : روش ها ، کاربرد ها و مزایا

 کروماتوگرافی مایع با بازده بالا یا کروماتوگرافی مایع با فشار بالا ( HPLC ) ❶ یک روش کروماتوگرافیک است که برای جداسازی مخلوطی از ترکیبات در شیمی تجزیه و بیوشیمی با هدف تعیین هویت ، تعیین مقدار ویا خالص سازی مورد استفاده قرار می گیرد. HPLC فاز معکوس ❷ که متداول ترین روش HPLC می باشد از بر هم کنش های آب گریز ( hydrophobic ) و نیروهای واندروالسی میان آنالیت با فازهای ساکن ( غیر قطبی ) و متحرک ( قطبی ) برای جداسازی اجزاء یک ترکیب بهره می برد.

HPLC چگونه کارمی کند ؟

در HPLC با مقاصد آنالیتیکال ، معمولا مقادیر اندکی از نمونه ( مثلا حدود 10μl ) به کمک ابزاری به نام شیر تزریق ❸به داخل جریانی از فاز متحرک ارسال می شود.این نمونه به همراه فاز متحرک وارد ستون جداسازی می شود .( انواع متفاوتی از ستون های جداسازی با مواد جاذب متفاوت و اندازه پارتیکل های مختلف در دسترس هستند). اجزاء تشکیل دهنده نمونه در خلال عبور از ستون به تدریج و تحت تاثیر برهم کنش ها میان آنها با فاز های متحرک و ثابت ، از یکدیگر جدا و بصورت مجزا از یکدیگر از داخل ستون خارج می شوند.

مدت زمانی که طول می کشد تا یک آنالیت تحت شرایط خاص از بقیه اجزاء ترکیب اولیه جدا و بصورت مستقل از ستون خارج شود به عنوان " زمان بازداری "❹ شناخته می شود " زمان بازداری " در واقع یک خصوصیت ویژه مربوط به ماهیت یک آنالیت یا ترکیب می باشد.

شکل 1 : مفهوم زمان بازداری ( Retention Time ) در یک کروماتوگرام

 

 

فاز ثابت در اصل همان پارتیکل های تشکیل دهنده ماده جاذب داخل ستون است که ممکن است ماهیت آب گریز یا قطبی داشته باشند. فاز های متحرکی که بطور معمول مورد استفاده قرار می گیرند شامل هر ترکیب قابل اختلاطی از آب و حلال های آلی نظیر استو نیتریل ومتانول هستند. فاز های متحرک بدون آب نیز می توانند مورد استفاده قرار گیرند.فاز متحرک ممکن است حاوی اسید هایی نظیر اسید فورمیک ، اسید فسفریک یا اسید تری فلوئورواستیک و یا نمک هایی برای جداسازی بهتر و موثرتر اجزاء نمونه باشد.

شستشوی ثابت ( isocratic ) و شستشوی شیب دار ( gradient )

در آنالیز به روش HPLC ترکیب فاز متحرک ممکن است در حین فرآیند جداسازی و شناسایی اجزاء ترکیب نمونه ثابت باشد و یا در حین آنالیز تغییر کند. بر این اساس دو گونه شستشوی کروماتوگرافیک تعریف می گردد : شستشوی ثابت یا ایزوکراتیک و شستشوی شیبدار یا گرادیان.

شستشو به روش ثابت یا ایزوکراتیک که در آن ترکیب فاز متحرک در طول فرآیند آنالیز ثابت می ماند ، روشی نسبتا آسان و کم هزینه است ولی در این روش با افزایش زمان بازداری در کروماتوگرام ، پیک ها بتدریج پهن و کوتاه می شوند و شناسایی آنها دشوار می گردد.

شستشو به روش گرادیان ، اگر چه کمی مشکل و هزینه بر است ، اما منجر به شکل گیری پیک های باریک و بلند در کروماتوگرام می شود که به خوبی شناسایی و تعیین مقدار می شوند.

شکل 2 : تفاوت عملی شستشوی ثابت ( isocratic ) با شیبدار ( gradient ) در بهبود کیفیت کروماتوگرام

 

فرآیند جداسازی در HPLC را با فرآیند استخراج مایع - مایع ❺ مقایسه کرده اند ، با این تفاوت که جداسازی در HPLC یک فرآیند پیوسته است و در استخراج مایع - مایع فرآیندی تدریجی و قدم به قدم می باشد.بطور کلی برای دستیابی به روشی دقیق و قطعی برای یک جداسازی مناسب در HPLC ، توصیه می گردد ابتدا فرآیند های جداسازی با بکارگیری شرایط مختلف بصورت آزمایشی و تا دستیابی به نتیجه مورد نظر انجام گیرد.

تولید کنندگان سیستم های HPLC

امروزه گزینه های HPLC بسیار زیادی در بازار وجود دارد. یکی از شرکت های مطرح در این زمینه ، شرکت دانش بنیان کیان شار دانش است که در ابتدای سال 1395 ، اولین سیستم های HPLC ساخت ایران را به بازار معرفی کرد. محصول این شرکت با نام تجاری " دان کروم DanChrom "❻ به بازار عرضه می گردد . مجموعه محصولات کروماتوگرافی مایع با نشان تجاری DanChrom در طول سال های گذشته از نظر کیفیت ، تنوع محصول و ظاهر دستگاه ، تحول سریعی یافته اند و در حال حاضر به رقیب جدی محصولات خارجی در بازار ایران تبدیل شده اند. سبد محصولات کروماتوگرافی شرکت کیان شار در سال 1399 شامل سیستم های HPLC از نوع آنالیتیکال و semi preparative بوده است که از پمپ های ایزوکراتیک و گرادیان 4 حلاله ، Vacuum Degaser ، آشکارساز های UV/Vis و PDA بهره می برند. این شرکت برنامه وسیعی برای توسعه محصولات خود دارد و در سال 1400 دستگاه های Fraction Collector و تزریق اتوماتیک نمونه Auto Injector را به بازار معرفی خواهد کرد. DanChrom نخستین و تنها سیستم HPLC است که در غرب آسیا تولید شده است .

مزایای HPLC

برخی مزیت های کلیدی روش دستگاهی HPLC عبارتند از :

1- امکان پذیر ساختن آنالیز قریب به اتفاق ترکیبات آلی غیر فرار ، به آسانی و در دماهای معمولی.

2- در دسترس بودن انواع آشکارساز ( دتکتور ) برای تعیین مقدار ترکیبات با خواص شیمیایی متفاوت.

3- کارکرد نسبتا آسان و سرعت عمل.

4- قیمت مناسب در مقایسه با سایر روش های پیشرفته تجزیه دستگاهی.

کاربرد های HPLC

هدف اصلی از تکنیک HPLC عبارت است از تعیین مقدار و خالص سازی یک آنالیت یا ترکیب خاص با انجام آنالیزهای کمی و کیفی. دستگاه های HPLC کاربردهای بسیار متعددی دارند که در زیر به برخی از آنها اشاره می گردد :

- شناسایی سموم و ترکیبات آلی در نمونه های آب

- ردیابی ناخالصی ها در فرآورده های دارویی

- پیش تغلیظ و جداسازی اجزاء کم مقدار از نمونه های گیاهی

- سنجش سطح خونی داروها به منظور تعیین سطح مناسب دارویی در بدن بیمار ( TDM ) ❼

- اندازه گیری آمینو اسید های خونی برای بررسی و تشخیص بیماری های متابولیک مانند فنیل کتونوری ، هموسیستونوری و ... 

 

--------------------------------------------------------------------------

 

❶ HPLC : High Performance Liquid Chromatography

❷ Reversed Phase HPLC

❸ Injection Valve

❹ Retention Time

❺ Liquid - liquid extraction

❻ DanChrom = Danesh + Chromatography

❼ Therapeutic Drug Monitoring

 

گردآوری و تنظیم : کورش کرباسیان


1399-11-01 16:24
بازدید : 160